本文討論的范圍包括RNA酶保護分析，northernblot，原位雜交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不談具體protocol，是因為各種書籍和kit說明書上都有，主要說一些原則，而且大部分是失敗和成功的經(jīng)驗，還有小組討論結果以及各種書里七零八落看的內容，希望對大家有用。

基因表達的定義：說到基因表達，是指RNA，還是蛋白？是指mRNA還是包括風頭正旺的非編碼RNA？mRNA還有不翻譯的RNA呢。應該說轉錄水平指的是RNA水平，而蛋白應該叫翻譯水平？我們這里就特指編碼蛋白的mRNA的量的檢測吧！ 

方法：很多很多，我們常用的也就是RT-PCR和northern。RNA沒保護分析在國外很常用，也有半定量的功能，一次性試劑盒還能以此將一個表達簇一起分析，例如NFkB的轉錄激活譜中的8個常見基因。dot blot的zui大貢獻是發(fā)展到了反向dot blot的――曾經(jīng)無*髦的基因芯片，而原位雜交的放大效應和它的假陽性使它的定量（半定量，應該根本算不上定量），用它定位和用蛋白定位的意義不可同日而語，又難做，只有新發(fā)現(xiàn)的基因可以在沒有得到蛋白和抗體的情況下進行組織或者細胞定位。

先談談RT-PCR吧。關于原位雜交和 dot blot大家可以和我論戰(zhàn)的，我曾經(jīng)看到一篇公開發(fā)表的文章把dot blot稱為定量檢測，是錯誤的。

1、模板均一性問題：愚見采用從RNA定量的方法似不妥，不要說PCR的本身的敏感度，即便是在反轉錄就有差異，到了cDNA的分裝和用于模板的取樣，這些都不能保證準確，當然在反轉錄階段我們也經(jīng)?？刂圃?或5ug，但這是為了再將來加樣的時候保證大致差不多，而且盡可能地利用反轉錄酶，而且RNA定量本身即使用電泳也不是那么準，更不要說分光光度計，這里說一下，我曾經(jīng)看到有人說用分光光度計定量，這也不是很準確，分光光度計只是掌握大概，當然用于反轉錄足夠了，但是用于rt－pcr的定量這是不正確的，很不準的，RNA也至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計比較不同標本之間就更不準了。 

2、RNA制備：一般制備總RNA 即可，有時需要制備mRNA，個人認為初學者還是選擇Trizol，大量制備采用傳統(tǒng)的方法自己配，實際上和trozol一樣的，有時效果還好，trizaol也就是混一混，但是優(yōu)點在于質量保證，使用方便，效率高，根據(jù)不同組織用trizol一般可以提到全部RNA的50%（別小看，這已經(jīng)很高了）以上，有些可以到達80%。mRNA用Qiagen的柱子，別去自己做Oligo（dT）柱，太麻煩。是否用DNAseI根據(jù)基因的特點和引物的設計，能夠跨內含子的就不需要處理，處理還是很危險的哦。像這樣的微量和也用不了多少次的實驗，并且如果牽涉到樣品是*的時候，因該選好的進口試劑。談到RNA的貯存實際上主要是溫度，至于放在TRIZOL中是不可取的，更不要說在胍里了，只－20是不夠的，至少－80，液氮zui保險，想想，在低溫里，即使加上些RNA酶它也降解不了哇！qiagen出了一種easy產(chǎn)品可用于保存標本，但在常溫也只是1天，所以低溫才是首要的，抽的時候也是這樣。 

3、反轉錄：常規(guī)，取樣盡量一致，如上所述，不是為了定量，是為了半定量PCR時圖形的好看。選擇逆轉錄酶根據(jù)實驗需要，少量的可用 Promega的一種1ug的酶，多的我們用invitrgen的5ug的II，當然有人說Promega和Roche的也不錯，用過，的確可以，要不 Invitrogen不像當初Gibco時那么牛了，也降價打折了。反轉錄成功后就不必太小心了，放在那里都可以，想想你還曾經(jīng)72度滅活呢，是不是？要知道，雜合雙鏈比DNA雙鏈還穩(wěn)定的。一般來說要擴增從反轉錄到PCR全過程的長達2kb以上的片斷是相當困難的事，很多長基因是通過隨機引物庫得到的而不是通過oligo （Td）得到的，不要說反轉錄,即使是PCR也是很困難的，不信可以從質粒里試試,至于反轉錄，就更是天方夜譚了，除了酶的效率等,還有RNA的二級結構等因素，這就要一些大公司的特殊的名貴的效果也未必好的酶了，Ｒoche和Invitrogen都有的.聽天由命吧。

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